在綜合考慮靈敏度、易用性和成本時，Elispot平臺很可能成為科研、治療和診斷領域開發多功能T細胞分析的上乘之選，在zui近方興未艾的細胞免疫治療方法開發中再獲關注。

在體外T細胞效應功能研究中，zui常用的分析包括流式細胞分析、Elispot、ELISA、多重微球芯片（又稱為多因子檢測或液相芯片等）和定量PCR。雖然每種分析都有著特定的優點和限制，但Elispot分析具有明顯的優勢：ELISpot就像基于流式細胞術的細胞內細胞因子染色（ICS），能直接確定抗原（Ag）特異的T細胞頻率——而這正是免疫診斷的核心競爭力。

這樣的分辨能力是上清分析所無法達到的，如ELISA或多重微球芯片，它們的測定是基于特定樣品孔中所有細胞產生的大量細胞因子。在急性HIV患者中，產生IFNγ以應答共同回憶抗原（如TT或PPD）的細胞頻率與健康個體相當，而斑點尺寸大大降低。這一結果表明，HIV特異的T細胞功能受到損傷，而非細胞數量減少。

同樣地，與“舊的”記憶T細胞相比，zui近體內激活的T細胞可能表現出每個細胞的細胞因子生產量有所增加。區分長期記憶亞群和zui近激活亞群的能力對自身免疫性疾病和慢性感染的T細胞診斷很有意義。大量分析結果被先天免疫系統的背景信號所混淆。抗原特異應答的稀釋導致整個信號峰變得扁平，而這個問題在檢測罕見群體的存在時影響zui大，例如PBMC中的循環腫瘤細胞（CTC）或骨髓中的散布腫瘤細胞，它們都是轉移的早期標志物。

已知T細胞能夠識別幾乎無限數量的可感染物質并且同時能將它們與自身區分開來，總的初始細胞庫包含≥1012種*的T細胞受體（TCR）特異性。因此，在不存在感染時，特異識別一種抗原的循環記憶細胞的出現頻率是相當低的，通常在1:10,000 -1,000,000。要檢測如此罕見的細胞，對于靈敏度的下限僅為0.02%的流式平臺來說*無法勝任。

而那些以培養上清檢測細胞因子的方法，如果液相芯片或ELISA，因周圍環境對分析物的稀釋、周圍細胞的吸收以及酶的降解，其檢測靈敏度會被進一步降低。相比之下，Elispot分析顯示出每100萬個PBMC中不到25個生產IFNγ的T細胞的檢測閾值（0.0025%）；這相當于檢測靈敏度提高了近10倍。Elispot分析的高靈敏度對過敏研究也很重要，其中鑒定極低頻率的Th2產細胞因子細胞對疾病監控和免疫療法的開發都很關鍵。特別是在流式細胞儀和ELISA平臺上都已證實不足以檢測的IL-4，而這正是Th2驅動應答的主要指標。

Elispot分析的開發始于1983年，是以平板為基礎的酶聯免疫吸附分析（ELISA）和以膜為基礎的Western blotting技術的融合，可實現在單細胞水平檢測分泌的分析對象。與標準的聚苯乙烯表面相比，聚偏二氟乙烯（PVDF）膜大大改善了抗體結合特性，更強的結合膜表面具有更高的Ab密度，帶來更明確的斑點。微孔板形式則進一步提高了操作通量，也容易實現自動化；更多樣品，更多刺激條件，或更多不同的細胞因子可在相鄰孔中同時平行。Elispot是可實現對單細胞進行生物學功能（如細胞因子的釋放）定量分析的少數幾種技術之一。

流式細胞儀剛剛啟動時會有不少樣品損失，與之不同，Elispot中的每個細胞都會被測定。Elispot 需要的細胞數僅為流式分析的十分之一，這對于那些珍貴的（如遠程取樣）和/ 或有限的（如細胞治療病人，小兒或免疫抑制檢測的受試者）的樣品至關重要。96孔板一直存在一個問題，即小規模分析中浪費了未使用的孔，比如單個患者樣品的診斷分析。默克生命科學特別提供了8聯管（目錄號M8ips4510），這種聯管是透明的，適合FluoroSpot應用，以及標準的酶學分析，表現與標準96孔板相當。

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ELISpot技術極為靈敏，但對操作經驗有一定的要求。在此，默克生命科學基于開發這個技術所積累的經驗，為您用好這個免疫細胞檢測的技術平臺提供非常有用的Tips，助您獲得而有意義的數據。 （生物谷 bioon.com）侵刪